如何正确配制4%多聚甲醛溶液

4%多聚甲醛的配制方法

多聚甲醛（Paraformaldehyde，PFA）是免疫组织化学（IHC）和免疫细胞化学（ICC）研究中最常用的固定剂之一。它能够很好地保存组织的抗原性和细微结构，适用于组织标本和细胞片的较长期保存，非常适合组织和细胞的光镜免疫化学研究。本文将详细介绍4%多聚甲醛的配制方法，以及相关注意事项，以帮助目标用户更全面地了解如何配制这一重要试剂。

一、配制原理

4%多聚甲醛固定液（4% Paraformaldehyde Fix Solution，4% PFA Fix Solution）是一种广泛用于免疫组化、免疫荧光、免疫细胞化学和流式分析等检测时组织、组织切片、细胞等生物样品固定的溶液。固定剂的主要作用是阻止内源性溶酶体酶对自身组织和细胞的自溶，抑制细菌和霉菌的生长，并通过凝固、生成添加化合物等使蛋白质内部结构发生改变，从而使酶失活。多聚甲醛溶液主要通过将甲醛聚合形成的多聚甲醛粉末溶解在磷酸盐缓冲液（PBS）中制备而成。

二、配制步骤

以下是4%多聚甲醛固定液的详细配制步骤：

材料准备

多聚甲醛粉末：4克

0.1M PBS溶液：100毫升（pH值7.4）

NaOH溶液（1N或0.1N，N是mol/L）：适量

蒸馏水：适量

磁力搅拌器：1台

容量瓶：100毫升或更大

pH计：1台

烧杯：适量

高压灭菌锅：1台（可选）

配制过程

1. PBS溶液的配制：

首先，配制0.1M PBS溶液。将80g NaCl、2g KCl、14.4g Na2HPO4和2.7g KH2PO4溶于800ml蒸馏水中。

使用HCl调节溶液的pH值至7.4。

最后，加蒸馏水定容至1L。

2. 多聚甲醛的溶解：

将4克多聚甲醛粉末加入100毫升已配好的0.1M PBS溶液中。

在通风厨中，使用磁力搅拌器加热至60℃以下，同时打开瓶盖使溶解。多聚甲醛在碱性条件下更易溶解，可适量滴加NaOH溶液促进溶解。

如果仍不溶解，继续加热并滴加NaOH溶液，直至溶液变得清亮。

3. pH值调节：

使用HCl调节溶液的pH值至7.4。

4. 定容与灭菌：

将溶液转移到容量瓶中，用PBS溶液或蒸馏水定容至所需体积。

（可选）在高压灭菌锅中进行高压蒸汽灭菌，至少20分钟，然后存于室温或4℃冰箱中备用。

三、注意事项

1. 配制环境：

在配制过程中，应在通风良好的环境下操作，避免直接接触或吸入多聚甲醛溶液，以防止对人体造成伤害。

2. 溶液存储：

配制好的4%多聚甲醛溶液应存放在4℃冰箱中，避免长时间放置在室温下，以防溶液中的醛基被氧化为酸，导致溶液pH值降低，影响染色效果。

3. 溶液使用：

本产品配制在PBS溶液中，可直接用于组织或细胞的固定，无需稀释。若需使用低浓度多聚甲醛，可使用PBS按比例稀释。

不同细胞或组织样品所需的固定时间有所不同，应当根据细胞或组织的种类以及组织块的大小来调整固定时间。

固定时间通常不宜超过24小时，因为多聚甲醛虽然作用温和，但能硬化组织，固定时间过久会导致组织变脆，切片时易碎。

4. 固定方法：

对于细胞样品，去除培养后，按照每六孔板加入1ml固定液的比例，加入4%多聚甲醛固定液，固定10-20分钟即可。后续需使用适当的洗涤液充分洗涤以除去残留的多聚甲醛。

对于细胞涂片、组织切片等其它细胞样品，加入固定液的量应以充分盖住样品为准。

对于组织块样品，浸泡在4%多聚甲醛固定液中，室温或4℃浸泡固定2-24h，建议不超过8h，除非组织块特别大，难以浸透。固定完成后，放入装有蒸馏水的离心管中清洗，每15-30min换一次水，共6-8次，建议在摇床上进行，或流水冲洗1-2